El jefe de Peter está haciéndole la vida imposible por causarle problemas emocionales a su hijo. Tampoco ayuda el joven detective Eddie Brock (Topher Grace) a quien Jameson ha contratado para averiguar por qué Mary Jane cambió a su hijo por Peter. Brock trabaja como un compañero fotógrafo del diario El Clarin.

Por si fuera poco, un preso fugado, Flint Marko, que fue el verdadero asesino del Tío Ben, se ve envuelto en un terrible accidente en una playa, donde permanecía escondido. Como consecuencia, se convierte en Sandman, una horrible criatura de arena, capaz de cambiar de forma. La investigación de Peter en el pasado de este "Hombre de arena" le lleva a contactar con dos cosas muy diferentes, pero que cambiarán su vida para siempre.

La primera es la joven Gwen Stacy, hija del nuevo jefe de policía, y que se siente atraída por Peter. La segunda, el simbiote, una sustancia negra que aparece en la escena de un accidente y que se funde con el disfraz de Peter para otorgarle nuevos poderes.

Pero las cosas empeoran cuando Harry Osborn, el hijo de Green Goblin, determinado a vengar la muerte de su padre la que atribuye a Peter, consigue el material necesrio para llevar sus planes a cabo. Equipado con una variante del traje de "Duende Verde" de su padre, se une a Sandman para causar problemas.

El caos resultante de todas estas acciones se cobra vidas, incluyendo la de personas muy cercanas a Peter. Mientras tanto, la sustancia negra que recubre su traje se separa para unirse a Brock y crear algo totalmente nuevo: Venom, una criatura diferente de todas a las que Peter se ha enfrentado, un "Veneno" al que Peter puede no ser capaz de parar.

.Peter descubre la existencia de este nuevo enemigo que se ha llevado a Mary Jane, por eso le pide ayuda a Harry pero este se niega. Spider-man tiene que luchar contra Venom quien le da una paliza hasta que aparece Harry en su traje de duende verde para el punto culminante de la película.